Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

v
SUMMARY
MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007.
“THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT
PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS”
Supervisors
HO THI NGA, MSc
NGUYEN KIEN CUONG, DMV
A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of
Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi
Minh City.
Chromosome is an element which affects the species genetics. Setting up
karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’
genetic mechanism. The most effective researching karyotype method is that
culturing and staining lymphocyte.
Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two
dosages, 0,4 ml and 1 ml. It was cultured in RPMI 1640 medium which
supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin),
antimycotic – antibiotic.
Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37
0
C. In
addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture. After 72 hours, we added
colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 min and 60 min before the cell was
fixed.
The best result was that culturing 1 ml rabbit peripheral blood and
incubating with colcemid in 60 min. Besides, the cells also grew and divided when
they were cultured in 15 ml falcon tubes. So that, we could replace Rough vase with
15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes. However, we haven’t established
rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides.



vi
MỤC LỤC

Trang
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các bảng x
Danh sách các hình xi
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2
1.2.1 Mục tiêu 2
1.2.2 Yêu cầu 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tổng quan về thỏ 3
2.1.1 Phân loài 3
2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý 3
2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ 3
2.2 Nhiễm sắc thể 4
2.2.1 Khái niệm 4
2.2.2 Hình thái và kích thƣớc 4
2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể 5
2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể 6
2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể ………………………….6
2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể 8
2.3 Chu Kỳ sống của tế bào 9
2.3.1 Gian kỳ 9

vii
2.3.1.1 Pha G1 10
2.3.1.2 Pha S 10
2.3.1.3 Pha G2 10
2.3.1.4 Phân bào 10
2.3.2 Nguyên phân 11
2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân 11
2.3.2.2 Các kỳ của phân bào 12
2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể 14
2.4.1 Kỹ thuật splash 14
2.4.2 Kỹ thuật squash 16
2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ 16
Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20
3.1 Thời gian và địa điểm 20
3.2 Đối tƣợng 20
3.3 Nội dung nghiên cứu 20
3.4 Vật liệu và hóa chất 20
3.4.1 Thiết bị 20
3.4.2 Dụng cụ 21
3.4.3 Hóa chất 21
3.5 Bố trí thí nghiệm 23
3.5.1 Thí nghiệm 1 23
3.5.2 Thí nghiệm 2 23
3.5.3 Thí nghiệm 3 24
3.5.4 Chỉ tiêu quan sát 24
3.6 Phƣơng pháp tiến hành 24
3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ 24
3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim 24
3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai 24
3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu 25

viii
3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể 26
3.6.3.1 Kỹ thuật trãi đều nhiễm sắc thể 26
3.6.3.1 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa 27
3.7 Xử lý số liệu 27
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid 28
4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy 29
4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml 31
4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy và nhuộm 35
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38
5.1 Kết luận 38
5.2 Đề nghị 38
CHƢƠNG 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

















ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleotide
ARN Acid ribonucleotide
Ctv Cộng tác viên
IU International unit
FBS Fetal bovine serum
NST Nhiễm sắc thể
PHA Phytohemaglutinin
PBS Phosphate buffer saline




















x
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài 5
Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thể 17
Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu 22
Bảng 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid 28
Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy 30
Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml 32



















xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1 Nhiễm sắc thể 4
Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể 6
Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể 7
Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể 8
Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào 9
Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm 13
Hình 2.7 Kiểu nhân tế bào thỏ đực 19
Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai 25
Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu 26
Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa 33
Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ 33
Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu 34
Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ 36
Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đều trên phiến kính 37
1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của cơ thể sống. Trong tế bào có chứa các
bào quan và nhân. Nhân tế bào là cấu thành bắt buộc của tế bào eukaryote, vì trong
nhân có chứa nhiễm sắc thể (NST), là cấu trúc mang vật chất di truyền ADN (acid
deoxyribonucleotide) của tế bào và cơ thể. Nhiễm sắc thể đƣợc quan sát đầu tiên bởi
Nageli năm 1842, nhƣng đến năm 1888, NST mới đƣợc Waldeyer đặt tên là
“chromosome” (“chromo” có nghĩa bắt màu nhuộm và “some” nghĩa là một thể)
(Eldridge, 1985). Nhiễm sắc thể đóng vai trò rất quan trọng trong di truyền của các
loài, một yếu tố quyết định cho sự tiến hóa hay suy thoái của giống nòi.
Có thể nói hơn 100 năm qua, chƣa có một cấu trúc sinh học nào nhƣ NST
đã đƣợc nhiều phòng thí nghiệm, nhiều nhà nghiên cứu, nhiều phƣơng tiện kỹ thuật
và kinh phí để nghiên cứu. Mục đích cuối cùng là làm sáng tỏ cấu trúc phân tử, siêu
vi thể cũng nhƣ cơ chế hoạt động của chúng trong tế bào. Một trong những kỹ thuật
nghiên cứu NST rất cổ điển nhƣng rất hiệu quả đó là phƣơng pháp nhuộm.
Với phƣơng pháp nhuộm, chúng ta có thể nghiên cứu đƣợc kiểu nhân
(karyotype) của một loài nào đó. Mà việc sử dụng bảng đồ kiểu nhân có tầm quan
trọng trong nghiên cứu di truyền tế bào, trong y học lâm sàng chẩn đoán bệnh di
truyền, bệnh ung thƣ, trong phân loại học cũng nhƣ trong công tác chọn giống cây
trồng và vật nuôi. Do đó tìm ra một quy trình nhuộm NST tối ƣu để nghiên cứu kiểu
nhân trong tế bào là điều rất cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ
Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm cùng với sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi
Thú Y, chúng tôi thực hiện đề tài “Bƣớc đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm
sắc thể trên tế bào máu thỏ”, để tạo cơ sở cho việc xây dựng kiểu nhân hoàn chỉnh
của thỏ, góp phần ứng dụng cho những nghiên cứu sau này.
2

1.2 Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu
Xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu trong máu thỏ.
1.2.2 Yêu cầu
- Thu nhận và nuôi cấy tế bào bạch cầu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ.
- Thử nghiệm quy trình nhuộm ở các mức thời gian ủ khác nhau.
- Thử nghiệm quy trình nhuộm với lƣợng máu nuôi cấy khác nhau.
- Thử nghiệm nuôi cấy tế bào máu thỏ trên ống nghiệm 15 ml.
















3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về thỏ
Thỏ có nguồn gốc từ thỏ rừng, đã đƣợc con ngƣời thuần hoá hơn 1000 năm
trƣớc công nguyên và trở thành thỏ nhà với tên khoa học là Oryctolagus Cesnoaclus
Domesticies.
2.1.1 Phân loài
־ Bộ gặm nhấm: Rodentia
־ Lớp: Lagomorpha
־ Loài: Orgctolagus
־ Họ thỏ: Leporides
2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý
־ Thân nhiệt: 39,5
0
C (biến động từ 30 – 41
0
C)
־ Nhịp tim: 120 - 160 lần/phút
־ Tần số hô hấp: 60 - 90 lần/phút
־ Nhiệt độ môi trƣờng thích hợp khoảng: 20 – 25
0
C
2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ
Lƣợng máu của thỏ chiếm khoảng 5,5% so với trọng lƣợng cơ thể. Thành
phần máu gồm huyết tƣơng và tế bào máu. Huyết tƣơng chiếm 60% thể tích, gồm
huyết thanh và chất sinh sợi huyết. Huyết tƣơng có vai trò vận chuyển chất hữu cơ
và vô cơ trong cơ thể (Dƣơng Nguyên Khang, 2006).
Máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Số lƣợng hồng cầu
khoảng từ 6 – 6,5 triệu trong 1 mm
3
máu, chiếm hơn 90% tế bào máu. Hồng cầu có
vai trò vận chuyển O
2
và CO
2
, điều hòa pH.
Số lƣợng tiểu cầu khoảng 300.000 trong 1 mm
3
máu. Tiểu cầu khi vỡ sẽ
sinh ra enzyme thrombokinase có tác dụng làm đông máu. Khi nuôi cấy tế bào máu,
ngƣời ta dùng heparin để kháng lại cơ chế đông máu. Heparin có trong đại thực bào
của gan, phổi và bạch cầu ƣa base, chúng không gây độc đối với tế bào.

Xem chi tiết: Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ